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基于光学相干断层扫描技术对体内肿瘤相关免疫细胞的实时追踪

人阅读 发布时间:2023-08-22 16:25

胶质母细胞瘤与其它脑癌一样会导致癫痫,恶心,呕吐和轻偏瘫,其中最重要的症状是不断恶化的记忆、性格或者神经衰退。目前对于胶质母细胞瘤的治疗主要集中于手术和放化疗。由于其肿瘤细胞的侵袭性,异质性和复杂的免疫微环境,使得新兴的免疫疗法难以应答,目前临床最重要的治疗手段仍是手术切除,但由于肿瘤组织边界不清晰,给临床手术造成了巨大的困扰。最近的研究表明,白细胞亚群,尤其是肿瘤相关巨噬细胞 (TAMs) ,可以对各种癌症免疫治疗策略的疗效产生重大影响。为了更好地研究和理解TAMs在确定免疫治疗结果中的作用,必须克服实体瘤在体动物模型中动态监测单细胞相关的重大技术挑战。然而,需要同时具备时间空间分辨率、细胞特异性对比度和组织深度增加时足够信噪比的成像技术 非常有限。在这里,我们描述了一种基于散斑调制光学相干断层扫描(SM-OCT)和优化造影剂的光谱散射的高分辨率、宽视场、纵向成像TAMs的方法。该方法对OCT检测灵敏度和降噪的改进使基于OCT的高分辨率观察活动物中特定宿主谱系的单个细胞成为可能。我们发现,在多形性胶质母细胞瘤小鼠体内原位模型中,表现出窄带增强散射截面的大金纳米棒(LGNRs)可以选择性地标记TAMs并激活小胶质细胞。我们展示了这些髓系亚群中细胞迁移的近实时跟踪。本文报道的固有时空分辨率、成像深度和对比灵敏度可能有助于在体内单细胞水平上详细研究TAMs和其他白细胞的基本行为,包括瘤内分布异质性和调节癌症增殖的作用。
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胶质母细胞瘤中LGNR滞留的高分辨率检测。

研究者使用原位移植胶质母细胞瘤小鼠模型后,在静脉注射LGNR造影剂后,如先前报道的,肿瘤血管内实现造影剂增强。(图1a)具有高形状单分散性(102.0 4.6 nm 27.1 1.7 nm)和光谱均匀性(λ max = 825 nm, fwhm = 95 nm)的LGNR被利用,因为它们在由源照明的多个光谱子集重建的OCT图像中易于识别对比度。(图1b)相对于周围的脑实质,侵袭性GBM的模型包括致密的细胞结构、相关宿主衍生免疫细胞水平的增加和异常曲折的血管。虽然这些特征在注射前的OCT图像中不明显,但GBM可以通过散射强度与健康的皮质组织区分开来。(图1c)尾静脉注射LGNRs可检测肿瘤内血管。(图1d)对于每只小鼠,作者一致地在肿瘤组织内40小时内注意到大量光谱点。肿瘤内光谱信号的点状分布与LGNR通过EPR外渗,然后在肿瘤微环境的特定细胞亚群内吞噬清除和积聚的模式一致。(图1e) 基于我们之前获得的LGNR在肝脏和脾脏组织内积累模式的结果,我们进一步预测负责这种摄取模式的细胞可能起源于中枢神经系统髓系群体。

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肿瘤内LGNR分布的评估

尾静脉注射后10分钟获得的图像结果显示了肿瘤内的血管结构。在40h时,LGNR信号在肿瘤中明显弥散,这种信号与血管的位置无关。(图2a)作者还开发了显示分段LGNR信号深度剖面的方法,揭示了肿瘤内颗粒的三维分布。(图2b)总的来说,作者观察到LGNR信号在注射后两个时间点均有增加。然而,在生物复制之间存在着很大的变异性,表面上是由一些变量引起的,包括血管密度和渗透性。考虑到肿瘤总体积后,这种变异性在一定程度上有所降低。但某种程度上的差异仍然存在。扩大这一观察结果,在小鼠注射后10分钟,血管中观察到的信号量与注射后40小时观察到的摄取之间似乎没有一致的相关性。(图2c)通过比较LGNR注射前和注射40小时时的分段体素分布,以评估假阳性的程度。(图2d)进一步分析了LGNR集群的大小分布,将其定义为分段体素的连续区域。当考虑单体素簇时,平均LGNR簇大小测量为1.8 0.2体素。考虑到体素尺寸,这对应的平均集群体积为130 12.2 μm3。(图2e)

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体内髓系细胞的LGNR定位

所有小鼠的健康大脑和肿瘤样本始终含有CD11b+ /CD45low细胞群,这些细胞被解释为小胶质细胞。相对于健康的脑样本,每只小鼠的肿瘤样本也含有大量CD11b+/CD45high细胞。(图3a)该表达谱虽然不全面,但与肿瘤相关巨噬细胞一致,已知巨噬细胞介导促肿瘤和抗肿瘤表型,并构成肿瘤微环境中复杂功能的一种表现形式。在对照组(n = 3)中,CD11b+ /CD45高细胞占健康脑样本中所有髓系细胞的5.2 1.8%,而从肿瘤样本中分离出的髓系细胞占24.6 - 5.2%。(图3b)与体内OCT结果一致,从健康脑组织中分离出的细胞(CD11b /CD45和CD11b+ /CD45low)显示出微不足道的LGNRs存在。而肿瘤分离的CD11b / CD45细胞不含LGNRs,CD11b+ /CD45low细胞群和CD11b+ /CD45高细胞群均出现LGNR聚集。(图3c)这些数据表明,在胶质母细胞瘤体内保留的部分LGNRs被隔离在CD11b+ /CD45高表达和CD11b+ /CD45低表达的髓性细胞中。CD45水平低的细胞有可能是小胶质细胞,而CD45水平高的细胞可能代表浸润的TAMs和活化的小胶质细胞的混合物。此外,在石蜡固定的肿瘤切片扫描电镜(SEM)图像中观察到造影剂的聚集定位也与细胞介导的LGNR摄取一致。(图3d)

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LGNRs和髓系标记物在组织中的共定位

作者进一步通过体外大脑和肿瘤组织的组织学分析,分析了LGNR负载细胞的表型特征和分布。与流式结果一致,免疫染色显示皮层组织中存在CD45low细胞,肿瘤中存在CD45high细胞。肿瘤组织中的一部分细胞也被CD68+染色呈阳性,CD68+被认为是吞噬活性巨噬细胞的标记物。进一步用HSM-AD分析免疫染色切片,检测LGNRs的存在。在无肿瘤皮层切片中LGNR信号可忽略不计。相比之下,LGNRs在肿瘤组织中普遍存在,并与CD45 +和CD68 +细胞共定位。(图4a)在肿瘤组织中,超过50%的CD68阳性像素也为LGNRs阳性。使用单独的方法,67.6%的CD68+簇(相邻区域)与LGNR +区域重叠。这些组织学数据进一步证实了髓系细胞介导的摄取是体内OCT成像中观察到的瘤内LGNR分布的起源。虽然并非所有CD68+细胞都摄取LGNR,但几乎所有检测到的LGNR都是在CD68+细胞内发现的,这表明肿瘤间质具有高效的吞噬清除。(图4b)皮层组织中有共表达Tmem119(小胶质细胞表达)33、34和IBA1(小胶质细胞和巨噬细胞表达)的细胞。在肿瘤组织中,Tmem119信号微弱或缺失的IBA1+细胞较多;但明显Tmem119 +细胞很少被观察到。(图4c)免疫荧光和HSMAD图像比较,肿瘤中LGNR +细胞为IBA1 +,Tmem119信号微弱或缺失。(图4d,4e)

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肿瘤相关髓系细胞的动态跟踪

肿瘤内巨噬细胞一旦被标记,它的生理行为可以动态监测。从注射后40小时开始,每15分钟进行一次3D SM-OCT扫描,显示肿瘤内标记白细胞分布(黄绿色,箭头表示)的变化,显示活跃的细胞迁移。(图5a,b)在相邻时间点(每7.5分钟,彩色编码)获得的分割图像的叠加显示了相对于肿瘤血管位置观察90分钟内单个标记细胞的运动轨迹。(图5c)肿瘤一旦被分割,可以在整个肿瘤体积上重建细胞轨迹,以便逐个细胞比较迁移距离和方向。(图5d)当以统一的扫描间隔获取体积扫描时,可以近似计算细胞迁移速度的变化(图5e),并随时间量化(图5f,g)。我们测量了所有标记细胞的平均速度为3 μ m/min,这与之前报道的巨噬细胞迁移速度一致。

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本文报道的方法为探索调节癌症生存和增殖的基本免疫过程提供了一个实验框架。根据最近的研究,这种方法可以为监测巨噬细胞对细胞介导的免疫疗法和更传统的癌症治疗方法的反应提供几个优势。作者实验室之前的工作表明,在某些情况下,有可能在体外向免疫细胞加载LGNRs并在全身给药后跟踪其在相关组织中的摄取。未来的离体标记的实施应探索扩大对比增强SM-OCT的使用,以研究与当前癌症免疫治疗策略相关的细胞群动态。

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